近年來(lái)，基于高通量測序的基因組拷貝數變異測序技術(shù)（Copy Number Variation sequencing，CNV-seq）可對染色體數目異常、大片段缺失/重復及致病性拷貝數變異進(jìn)行檢測，在產(chǎn)前診斷、輔助生殖、兒科遺傳病輔助診斷等領(lǐng)域得到了廣泛應用。
為助力臨床精準診斷，博奧晶典在常規CNV-seq檢測23對染色體非整倍體和>100Kb染色體拷貝數變異的基礎上進(jìn)行優(yōu)化升級，同步推出檢測試劑盒（RUO）和LDT檢測服務(wù)。CNV-seq plus不僅能實(shí)現特定UPD檢測、三倍體檢測和母源污染鑒定，還能為臨床提供本土化樣本檢測、數據解讀和報告生成的一體化解決方案，進(jìn)一步助力臨床提高診療效率。
CNV-seq檢測ROH的目的：篩查UPD
什么是ROH？
基因組純合區域（regions of homozygosity, ROH）是指基因組區域中一定范圍內連續呈現的雜合性丟失的現象。對于大部分的二倍體細胞如人類(lèi)體細胞，擁有兩份基因組，一份來(lái)自于父親，另一份來(lái)自于母親。在某一個(gè)等位基因位點(diǎn)上，如果來(lái)自父本和母本的堿基不同時(shí)，則該位點(diǎn)為雜合（heterozygous）；如果因為某種機制（如遠親關(guān)系或近親關(guān)系婚姻或基因轉換）導致在一定范圍內連續的等位基因序列都是純合子而無(wú)雜合子（拷貝數仍為 2 個(gè)），則該區域為ROH。如檢出多條染色體上均存在大片段 ROH 時(shí)需考慮父母親緣關(guān)系（consanguinity）；如果僅在一條染色體發(fā)現≥10Mb的ROH，應優(yōu)先考慮單親二體（uniparental disomy，UPD）的可能【1,2】。
什么是UPD？
UPD是指一個(gè)個(gè)體的兩條同源染色體都來(lái)自同一親本，或來(lái)自父母一方的染色體片段被另一方的同源部分取代。UPD的產(chǎn)生機制主要有三體細胞自救、單體細胞的自身復制（單體自救）等【3】。Nakka等【4】對440多萬(wàn)份樣本研究后發(fā)現，UPD在活產(chǎn)兒中的發(fā)生率可達1/2000。當UPD出現在基因印記區域時(shí)，子代可能會(huì )遺傳兩個(gè)均有表達活性的等位基因，也可能遺傳兩個(gè)表達沉默的等位基因，從而導致基因劑量表達異常。
目前已知當第 6、7、11、14、15及20號染色體存在UPD時(shí)，可通過(guò)基因組印跡障礙導致疾病的發(fā)生【5】。常見(jiàn)的UPD綜合征及主要表型詳見(jiàn)表1，其中Angelman 綜合征發(fā)病率約為1/20,000-1/12,000【6】，臨床表型包括小頭，共濟失調，癲癇，智力發(fā)育遲滯，語(yǔ)言能力差，微笑面容。
為什么要檢測UPD？
大多數染色體UPD沒(méi)有臨床表型，當UPD發(fā)生在印記基因區域則會(huì )導致印記基因異常，出現異常的表型。目前針對上述UPD綜合征（表1）尚無(wú)有效的治療手段，因此，早發(fā)現、早診斷、早干預對于此類(lèi)疾病的防控尤為重要。
產(chǎn)前篩查或診斷中如果發(fā)現涉及第 6、7、11、14、15及20號染色體的嵌合、NIPT篩查三體高風(fēng)險或相關(guān)超聲異常（如父源性14號染色體UPD的特殊鐘形胸廓）或涉及14、15號染色體的羅伯遜易位、平衡易位等，應考慮進(jìn)行UPD檢測。2020年ACMG指南發(fā)布了關(guān)于UPD產(chǎn)前診斷的聲明【7】，建議對如下人群在產(chǎn)前診斷時(shí)應檢測UPD：孕婦高齡；采用PGT助孕，打算植入有印記染色體嵌合胚胎；穿刺絨毛或穿刺羊水提示印記染色體三體或單體嵌合；產(chǎn)前超聲異常與某種UPD疾病表型一致；絨毛穿刺或羊水穿刺提示存在遺傳的或新發(fā)的涉及14號或15號染色體的羅氏易位或者等臂染色體；新發(fā)的小標記染色體（sSMC），但不帶有明顯常染色質(zhì)；發(fā)生在非羅氏易位的印跡染色體的3：1分離可能導致三體或單體挽救或配子補救。
UPD的檢測方法
UPD的檢測方法主要包括STR分型技術(shù)、SNP分型技術(shù)、甲基化PCR與甲基化MLPA 技術(shù)。其中最為經(jīng)典的是STR分析，但通常不用于一線(xiàn)篩查，商業(yè)化的STR檢測試劑盒僅檢測特定的STR位點(diǎn)，難以覆蓋常見(jiàn)的UPD綜合征?；赟NP分型的UPD檢測技術(shù)主要包括染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis, CMA）、全外顯子組測序等方法，通過(guò)分析SNP位點(diǎn)的雜合性識別ROH，僅適用于單親同二體型的UPD檢測，檢測靈敏性和分辨率與SNP探針的密度和分布有關(guān)。甲基化PCR和MLPA技術(shù)直接針對目標UPD綜合征相關(guān)的關(guān)鍵印記基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，對于病因的確診有重要意義，通常用于UPD驗證。
打破技術(shù)局限，博奧晶典自主研發(fā)基于CNV-seq測序數據的ROH檢測系統
CNV-seq技術(shù)是基于低深度全基因組測序的新一代拷貝數變異檢測方法，具有通量高、操作簡(jiǎn)便、兼容性高等優(yōu)勢，對于小的CNV以及低比例嵌合的CNV具有良好的檢測效能，在臨床得到了廣泛的應用。但是，業(yè)內普遍認為CNV-seq技術(shù)僅適用于染色體拷貝數變異的檢測，無(wú)法檢測單親二倍體UPD在內的ROH，這在一定程度上限制了CNV-seq在產(chǎn)前診斷中的應用。2019年4月發(fā)布的《低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應用專(zhuān)家共識》【8】建議，臨床高度懷疑胎兒為單親二倍體時(shí)，應結合STR或 SNP array等技術(shù)進(jìn)行檢測。
目前臨床應用的CNV-seq測序技術(shù)覆蓋的SNP位點(diǎn)reads的平均深度1X左右，難以識別UPD和ROH。通過(guò)提高測序深度，或基于高深度測序法雖然可以解決UPD和ROH的檢測問(wèn)題，但測序成本會(huì )隨著(zhù)測序深度的增加而大幅增加。因此，如何使用低測序深度的數據滿(mǎn)足ROH/UPD的檢測需要，是一項極具挑戰的工作。
針對上述難題，博奧晶典的研究科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了基于全基因組低深度測序CNV-seq的ROH檢測技術(shù)，此項技術(shù)于2020年8月獲發(fā)明專(zhuān)利授權（ZL202010896507.5）。本方法基于生物信息學(xué)分析方法的創(chuàng )新實(shí)現ROH的檢測，在不增加測序深度、測序成本和實(shí)驗操作的情況下，能支持深度低至0.1~0.2X的ROH檢測。研究組基于臨床CNV-seq 0.15~0.4X的測序深度數據開(kāi)創(chuàng )性地提出SNP混合雜合度指標（SMHS）的計算方法，表明在極低測序深度下（低至0.2X覆蓋深度），雖然每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型不可知，但是通過(guò)合并計算N個(gè)SNP雜合信息，計算SMHS得分可以檢測多倍體和ROH。該算法打破了現有低平均測序深度數據不能用于判斷ROH和多倍體的局限，這意味著(zhù)不增加檢測數據量的條件下就可以分析多倍體和ROH區域，不僅能顯著(zhù)降低檢測成本還能縮短檢測周期，給產(chǎn)前診斷工作和社會(huì )帶來(lái)巨大效益。
圖1 博奧晶典基于CNV-seq測序數據檢測多倍體和基因組純合區域ROH的系統專(zhuān)利技術(shù)
博奧晶典CNV-seq系列產(chǎn)品全面升級，在原有產(chǎn)品檢測23對染色體非整倍體、100Kb以上缺失/重復的基礎上，新開(kāi)發(fā)了特有的生信算法并獲得專(zhuān)利授權，新增基因組純合區域ROH檢測，可提示全基因組UPD和10種>10Mb的致病性ROH；此外，博奧晶典自主研發(fā)的基于BES4000的SNP分型技術(shù)有效提示三倍體異常和定量鑒定5%以上的樣本交叉污染，為臨床提供更具性?xún)r(jià)比的檢測產(chǎn)品，為出生缺陷精準防控提供更全面的解決方案。
升級產(chǎn)品介紹
參考文獻
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